ахбор

IPTG (изопропил-β-D-тиогалактозид) як аналоги субстрати β-галактозидаза мебошад, ки хеле индуктивӣ аст.Дар зери индуксияи IPTG, индуктор метавонад бо протеини репрессор як маҷмӯа ба вуҷуд орад, то конформатсияи сафедаи репрессор тағир ёбад, то он бо гени ҳадаф муттаҳид карда нашавад ва гени мақсаднок самаранок ифода карда шавад.Пас, консентратсияи IPTG дар давоми таҷриба чӣ гуна бояд муайян карда шавад?Оё калонтар ҳамон қадар беҳтар аст?
Аввалан, биёед принсипи индуксияи IPTG-ро фаҳмем: Оперони лактозии E. coli (элемент) дорои се генҳои сохторӣ, Z, Y ва A мебошад, ки мутаносибан β-галактозидаза, пермеаза ва ацетилтрансферазаро рамзгузорӣ мекунанд.lacZ лактозаро ба глюкоза ва галактоза ё ба алло-лактоза гидролиз мекунад;lacY имкон медиҳад, ки лактоза дар муҳити атроф аз мембранаи ҳуҷайра гузарад ва ба ҳуҷайра дохил шавад;lacA гурӯҳи ацетилро аз ацетил-КоА ба β-галактозид интиқол медиҳад, ки он бартараф кардани таъсири токсикро дар бар мегирад.Илова бар ин, пайдарпаии амалиётии O, пайдарпаии ибтидоии P ва гени танзимкунандаи I вуҷуд дорад. Рамзи ген I сафедаи репрессорӣ мебошад, ки метавонад ба мавқеи O-и пайдарпаии оператор пайваст шавад, то оперон (мета) репрессия карда шавад ва хомӯш.Инчунин макони ҳатмӣ барои фаъолкунандаи гени катаболикии протеин-CAP дар боло аз пайдарпаии оғозкунандаи P мавҷуд аст. Пайдарпаии P, пайдарпаии O ва макони ҳатмии CAP якҷоя минтақаи танзимкунандаи лак оперонро ташкил медиҳанд.Генҳои рамзгузории се фермент аз ҷониби як минтақаи танзимкунанда барои ноил шудан ба ифодаи ҳамоҳангшудаи маҳсулоти ген танзим карда мешаванд.

Дар сурати набудани лактоза, лак оперон (мета) дар ҳолати репрессия қарор дорад.Дар ин ваќт репрессори лак, ки бо пайдарпаии I тањти назорати пайдарпаии промотори PI ифода шудааст, ба пайдарпаии О мепайвандад, ки он аз пайвастшавии полимеразаи РНК ба пайдарпаии Р монеъ мешавад ва ибтидои транскрипсияро бозмедорад;Вақте ки лактоза мавҷуд аст, лак-оперон (мета) метавонад ба вуҷуд ояд Дар ин системаи оперон (мета) индуктори воқеӣ худи лактоза нест.Лактоза ба ҳуҷайра ворид мешавад ва тавассути β-галактозидаза катализ мешавад ва ба аллолактоза табдил меёбад.Охирин ҳамчун молекулаи индуктор бо сафедаи репрессор пайваст шуда, конформатсияи сафедаҳоро тағир медиҳад, ки ба ҷудошавии сафедаи репрессор аз пайдарпаии О ва транскрипсия оварда мерасонад.Изопропилтиогалактозид (IPTG) ба мисли аллолактоза таъсир мерасонад.Ин як индуктори хеле пурқувват аст, ки онро бактерияҳо мубодила намекунанд ва хеле устувор аст, бинобар ин дар лабораторияҳо васеъ истифода мешавад.

Консентратсияи оптималии IPTG-ро чӣ гуна бояд муайян кард?E. coli-ро мисол мегирем.
Штамми аз ҷиҳати генетикӣ муҳандисии E. coli BL21, ки дорои рекомбинати мусбати pGEX (CGRP/msCT) мебошад, ба муҳити моеъи LB дорои 50μg·mL-1 Amp васл карда шуд ва шабона дар 37°C парвариш карда шуд.Фарҳанги дар боло зикршуда ба 10 шишаи 50 мл муҳити моеъи тару тозаи LB, ки дорои 50μg·mL-1 Амп дар таносуби 1:100 барои фарҳанги васеъшавӣ аст, эм карда шуд ва вақте ки арзиши OD600 0,6 ~ 0,8 буд, IPTG ба консентратсияи ниҳоӣ илова карда шуд.Он 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 ммоль · L-1 аст.Пас аз индуксия дар ҳамон ҳарорат ва як вақт, аз он 1 мл маҳлули бактериявӣ гирифта шуд ва ҳуҷайраҳои бактериявӣ бо центрифуга ҷамъоварӣ карда шуданд ва ба SDS-PAGE барои таҳлили таъсири консентратсияи гуногуни IPTG ба ифодаи сафеда гузаронида шуданд ва сипас консентратсияи IPTG бо бузургтарин ифодаи сафеда интихоб кунед.
Пас аз таҷрибаҳо маълум мешавад, ки консентратсияи IPTG то ҳадди имкон зиёд нест.Ин сабаби он аст, ки IPTG барои бактерияҳо заҳролудшавии муайян дорад.Зиёда аз консентратсияи ҳуҷайра низ кушта мешавад;ва умуман, мо умедворем, ки сафедаи ҳалшаванда дар ҳуҷайра бештар ифода карда шавад, ҳамон қадар беҳтар аст, аммо дар бисёр ҳолатҳо, вақте ки консентратсияи IPTG хеле баланд аст, миқдори зиёди инклюзия ба вуҷуд меояд.Бадан, аммо миқдори сафедаи ҳалшаванда кам шуд.Аз ин рӯ, консентратсияи мувофиқтарини IPTG аксар вақт на зиёдтар аст, ҳамон қадар беҳтар аст, балки консентратсияи пасттар аст.
Мақсади индуксия ва парвариши штаммҳои аз ҷиҳати генетикӣ таҳияшуда баланд бардоштани ҳосили сафедаи мақсаднок ва кам кардани хароҷот мебошад.Ба ифодаи гени мақсаднок на танҳо аз омилҳои худи штамм ва плазми экспрессия, балки ба дигар шароитҳои беруна, аз қабили консентратсияи индуктор, ҳарорати индуксия ва вақти индуксия низ таъсир мерасонад.Аз ин рӯ, дар маҷмӯъ, пеш аз ифода ва тоза кардани сафедаи номаълум, беҳтар аст, ки вақти индуксия, ҳарорат ва консентратсияи IPTG-ро омӯзед, то шароити мувофиқро интихоб кунед ва натиҷаҳои беҳтарини таҷрибавӣ ба даст оред.